در حالی که HPLC در تشخیص طبی مزایای زیادی دارد اما بدون چالش هم نیست. ماتریس‌های نمونه پیچیده، تداخل‌ها و اعتبارسنجی روش، مسائل رایجی هستند که در تشخیص‌های طبی مبتنی بر HPLC با آن مواجه می‌شوند. علاوه بر این، هزینه تجهیزات HPLC و مواد مصرفی و همچنین زمان مورد نیاز برای آماده سازی و تجزیه و تحلیل نمونه، می تواند چالش هایی را برای آزمایشگاه ها ایجاد کند. با این حال، پیشرفت‌های مداوم در فناوری و روش‌ها با هدف رفع این محدودیت‌ها، بهبود کارایی و اثربخشی تشخیص‌های مبتنی بر HPLC انجام می‌شود.